高性价比流式细胞仪滤光片让检测信号更清晰

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）基于激光和免疫荧光技术，对悬浮单细胞 / 微粒进行快速、多参数定量分析与分选。将样本细胞悬液导入流动室，鞘液高速包裹样本流，依靠流体动力学聚焦，使细胞被挤压成单个依次排列通过，形成单细胞液柱，逐个通过激光照射区；细胞组分或结合的荧光染料被激光激发，细胞上标记的荧光抗体/染料受激发发出特定波长荧光，不同荧光对应不同生物标志物，通过信号采集与转换系统收集这些信号，实现细胞分选和多参量数据分析。

• 流式细胞仪分类及核心光路构成
• 传统流式细胞仪按照是否可以进行细胞分选：分选型流式细胞仪，分析型流式细胞仪。后来又逐渐衍生出质谱流式、光谱流式、成像流式等多种细分类型。
• 流式细胞仪典型应用
• 1.临床诊断中应用于肿瘤检测、免疫功能评估、造血干细胞移植。
• 2. 基础科研：免疫学、肿瘤生物学、细胞生物学等
• 3. 生物医药： CAR‑T 等细胞药物研发与质控， 药物筛选。
• 流式细胞仪光路结构
• 光学系统：激光 + 透镜 + 二向色镜+滤光片 + 检测器PMT
• 当细胞/颗粒通过检测点时，激光束照射到单个细胞/颗粒上，产生前向角散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）以及荧光信号。所有这些光被透镜收集，二向色镜和滤光片分离并导向相应的检测器，在PMT等检测器内转化为光电信号。
• 常见激光器波长有：355nm、405nm、488nm、561nm、633nm等；滤光片通常包含激发滤光片、发射滤光片、二向色镜等，其光谱类型通常为高性价比带通滤光片、长波通、短波通滤光片。检测器包括光电倍增管PMT,光电二极管PD,雪崩二极管等。
• 激发光谱、发射光谱和斯托克斯位移
• 激发光谱：保持检测器接收的荧光发射波长不变，连续改变照射染料的激发光波长，测量对应的输出荧光信号强度。并以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘图，得到激发光谱。物理含义：反映该荧光染料对不同波长激发光的吸收能力，实际在流式细胞仪中往往选择激光器波长恰好落在染料激发光谱峰值附近，实现最高效率激发。
• 发射光谱：激发光波长固定，使用光栅 / 滤光片扫描接收不同波长的荧光，记录各波长的荧光强度。以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到发射光谱。流式细胞仪依靠发射光谱差异，选用不同带通滤光片分离不同染料信号。
• 斯托克斯位移：荧光发射光谱峰值波长 与 激发光谱峰值波长之间的波长差。斯托克斯位移一定为正值；荧光波长总是比激发光波长更长。
• Δλ=λem(max)−λex(max) 其中λem(max)：发射光谱最大荧光波长；λex(max)：激发光谱最大吸收波长。​
• 斯托克斯位移大：激发峰与发射峰分得很开，容易用滤光片把激发散射光和荧光分开，检测信噪比高。。
• 斯托克斯位移小：发射光谱靠近激发光，散射光干扰严重，容易串扰；对滤光片要求极高。
• 流式细胞仪滤光片
• 激发滤光片光谱类型通常是带通滤光片,发射滤光片光谱类型可以是带通滤光片,也可以是高陡度长波通截止滤光片。二向色镜是45°设计使用的干涉截止滤光片,光谱类型有长波通,短波通。
• 衰减水平（OD)：薄膜干涉滤光片主要通过反射进行阻隔，术语“光密度OD”描述背景杂散光的衰减水平更为精确。Abs吸光度：和光密度值计算方法一致，表示吸光效率。
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• 交叉隔离度：它描述了激发和发射滤光片交叉点对应的最小衰减水平(在特定范围内)。在对荧光滤光片组合的激发滤光片与发射滤光片进行匹配时，此值很重要，描述二者相互隔离不被干扰的水平。
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• 斜率：描述了带通或者截止滤光片从透过到截止过渡的锐度。斜率可以通过说明特定滤波器必须具有指定阻挡水平的波长来指定。
• 入射角(AOI)：大多数类型的滤光片，如薄膜干涉涂层，都是“角度敏感型”的，这意味着其光谱特性随角度而变化。如果要在会聚或发散光束中使用滤光片，则可能需要指定入射光的半锥角。半锥角也可以用光束的f值或数值孔径(NA)来描述，它等于半锥角的正弦。非垂直入射的二向色镜需要考虑偏振分离，效果依据设计和入射波长决定。
• 陡度和垂直度：光谱信号的“垂直度”也很重要，因为它可以在通带中的高透过率到高OD衰减之间实现更陡峭的过渡。滤光片形状越方，表明带通（或截止）滤光片的边缘越垂直。在拉曼光谱中尤其重要。设计具有更陡峭斜率或更高垂直度的带通滤波器只需向滤光片添加更多腔层就可以实现。
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• 通带波纹和插入损耗：增加腔层结构可能会给通带带来不希望的纹波和损耗，从而导致最终图像的对比度降低。通过膜层厚度优化和提高监控精度可以解决这一问题。
• 不同的荧光检测通道对应不同的荧光染料或者荧光探针,每个通道对应一组激发、发射滤光片。例如 FAM/SYBR Green 激发:470nm 发射:520nm ；VIC/HEX/JOE 激发:530nm 发射:570nm；ROX 激发:580nm 发射:610nm ；Cy5/Texas Red 激发:620nm 发射:680nm等。